在掃描電子顯微鏡 (SEM) 中，對某些敏感樣品進行冷凍處理可以顯著減少電子束損傷，特別是對一些生物樣品、聚合物或其他低導電性材料。冷凍 SEM 技術（Cryo-SEM）通過將樣品快速冷凍并維持低溫環(huán)境來避免電子束引起的樣品變形或損壞。以下是如何在 SEM 中進行樣品冷凍以減少電子束損傷的步驟和方法。

1. Cryo-SEM 的原理

Cryo-SEM（冷凍掃描電鏡）通過快速冷凍樣品并維持在低溫度下成像，避免了電子束在樣品上產生的熱效應和化學變化。這種方法的主要目的是：

防止水分蒸發(fā)，特別是對含水的生物樣品或水凝膠類材料。

通過降低溫度來減少電子束引起的損傷、熱效應和樣品帶電效應。

保持樣品的自然狀態(tài)而不需要進行復雜的化學固定或鍍膜。

2. 樣品制備步驟

冷凍 SEM 樣品的制備是 Cryo-SEM 成像中關鍵的部分。以下是典型的樣品制備流程：

1) 快速冷凍（快速凍結）

樣品需要通過快速冷凍（通常稱為 vitrification）來保持樣品原始狀態(tài)，避免冰晶的形成。

常用的方法包括浸入冷凍或高壓冷凍。浸入冷凍：將樣品快速浸入液氮或液氮溫度的液體（如液態(tài)丙烷）。這一過程可使水分以玻璃態(tài)（非晶態(tài)）凍結，避免晶體冰的形成。

高壓冷凍：使用高壓冷凍裝置對樣品施加高壓，迅速降低溫度以抑制冰晶生成。

2) 轉移到冷凍樣品臺

冷凍后的樣品需要在低溫環(huán)境下轉移到 SEM 的冷凍樣品臺上。這通常是通過冷凍轉移桿進行的，確保樣品不與環(huán)境接觸，避免升溫。

樣品的溫度通常保持在 -140°C 到 -196°C，具體取決于樣品的特性和成像要求。

3) 樣品鍍膜

雖然低溫可以減少樣品損傷，但仍然有些樣品（如絕緣材料或生物樣品）在電子束下可能產生帶電效應。這時可以使用低溫鍍膜技術（通常為金、鉑或碳），在樣品表面沉積一層導電薄膜來減少帶電效應。

鍍膜過程也須在低溫下進行，以保持樣品的冷凍狀態(tài)。

3. SEM 冷凍系統(tǒng)操作

冷凍樣品準備好后，需要將其插入到 SEM 中的冷凍系統(tǒng)?，F(xiàn)代 Cryo-SEM 通常配備了冷凍臺和低溫裝置，可以穩(wěn)定保持樣品的冷凍狀態(tài)。

1) 加載樣品

使用冷凍轉移桿將樣品從冷凍準備臺轉移到 SEM 的冷凍樣品室。

樣品被安裝在冷凍樣品臺上，并通過液氮冷卻系統(tǒng)保持低溫。

2) 調節(jié)溫度

通過 SEM 的軟件接口，可以設定并監(jiān)控樣品臺的溫度。通?？刂圃?-150°C 到 -190°C，具體取決于樣品的特性。

樣品在整個成像過程中需要保持在設定溫度，以避免由于溫度波動而導致樣品變形或損壞。

4. 電子束設置與操作

在 Cryo-SEM 中，電子束的參數(shù)設置也應根據(jù)樣品的低溫特性進行調整，以進一步減少電子束損傷：

降低加速電壓：低導電性樣品容易受到電子束損傷，因此需要使用較低的加速電壓（例如 1 kV 到 5 kV），減少對樣品的損傷。

降低束流密度：減少電子束的強度和束流密度也能降低熱效應和損傷。

控制掃描速度：通過使用較慢的掃描速度，能夠進一步減小熱累積，并有助于減少對樣品的損壞。

5. 低溫成像技術

在低溫環(huán)境下進行成像可以大幅減少樣品的損傷，特別是在生物學和材料科學領域。以下是兩種常見的成像方式：

1) 冷凍斷裂法（Cryo-fracture）

對于細胞或其他多層樣品，冷凍斷裂技術能夠在低溫度下將樣品斷裂，暴露內部結構。隨后可直接在 SEM 中成像，以觀測次表面結構。

樣品斷裂后，仍需保持在冷凍臺上，并進行成像操作。

2) 冷凍蝕刻（Cryo-etching）

在某些情況下，樣品表面被冷凍覆蓋的物質（如水分）會影響成像。冷凍蝕刻可以通過逐步升溫，讓樣品表面升溫到略高于冷凍溫度（如 -90°C 到 -100°C），以輕微升華表面水分，暴露出樣品的表面結構。

該過程使樣品表面更加清晰，有利于高分辨率成像。

6. 成像后處理與升溫

在成像結束后，樣品通常需要經過升溫和解凍處理：

升溫控制：逐步升溫可以避免樣品因快速升溫而破壞結構，特別是在需要進一步處理或分析的情況下。

樣品處理：根據(jù)樣品性質，可以在升溫后對其進行其他表面處理、化學分析或保存。

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